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潮霉素B Hygromycin B的使用方法總結(jié)
   潮霉素B Hygromycin B的使用方法總結(jié)

  1. 儲存液的配制(50mg/ml)

  稱取0.5g 潮霉素B加入10ml無菌去離子水內(nèi)使其*溶解。先用5ml無菌去離子水預(yù)濕潤0.22μm針頭式過濾器,除盡水。之后使用此濾器過濾潮霉素B溶液,除菌后分裝成單次使用的小量(如1ml)放到-20℃凍存,約1年穩(wěn)定。

  2. 常用篩選濃度

  注意:潮霉素B用來篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型,培養(yǎng)基,生長條件和細(xì)胞代謝率而變化,推薦使用濃度為50-1000μg/mL。對于*次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過建立殺滅曲線(kill curve),即劑量反應(yīng)性曲線,來確定*篩選濃度。

  一般而言,哺乳動物細(xì)胞50-500μg/mL;細(xì)菌/植物細(xì)胞20-200μg/mL;真菌300-1000μg/mL。

  3. 殺滅曲線的建立

  注意:為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株,需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素zui低濃度,可通過建立殺滅曲線(劑量反應(yīng)曲線)來實(shí)現(xiàn),至少選擇5個濃度。

  1) *天:未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上,37℃,CO2培養(yǎng)過夜;注:對于需要更高密度來檢測活力的細(xì)胞,可增加接種量。

  2) 根據(jù)細(xì)胞類型,設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動物細(xì)胞為例,可設(shè)定50,100,250,500,750,1000μg/mL。先用去離子水按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/ml,然后按照下表稀釋到相應(yīng)濃度的工作液。

  3) 第二天:替換舊的培養(yǎng)基,換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔。

  4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

  5) 按照固定的周期(如每2天)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)(通常是7-10天)內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

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